降溫程序是決定冷凍效果的另一個關(guān)鍵因素。細(xì)胞內(nèi)部易形成冰晶對細(xì)胞造成損傷；若降溫速度過慢，會因細(xì)胞外部介質(zhì)的水分結(jié)冰而導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水死亡。因為-60~0℃的低溫對細(xì)胞的損傷**，因此要選擇合適的降溫程序，讓細(xì)胞在能夠適應(yīng)溫度驟變的前提下，迅速安全地通過這個溫度危險區(qū)，提高冷凍效果。根據(jù)研究的數(shù)據(jù)和相關(guān)報道，在精超低溫冷凍前先于4℃平衡15~25min，再于距離液氮面15cm處停留5min，在距離液氮面5cm處停留10min，可使櫛江珧、近江牡蠣、馬氏珠母貝等精冷凍效果達(dá)到**。樣品體積對冷凍效果也有影響。樣品體積的不同可能影響了熱的交換，體積小的樣品降溫快，體積大的樣品降溫慢，這間接造成了降溫條件的差異，導(dǎo)致精活率不一樣。關(guān)于雙殼類適冷凍體積的探討，朱豪磊認(rèn)為香港牡蠣在冷凍體積為0.75mL時復(fù)蘇效率高；李純認(rèn)為紫貽貝、櫛孔扇貝和菲律賓蛤仔的適精冷凍體積分別為0.4、1和1mL。有研究的數(shù)據(jù)顯示，櫛江珧和近江牡蠣精在冷凍體積為1.0~1.4mL的范圍內(nèi)保存效率高。分析以上研究結(jié)果不同的原因，一方面是物種間的差異，更重要的是降溫程序存在差異。柯亞夫等認(rèn)為，不同體積的樣品保存時要對應(yīng)不同的降溫方法，以達(dá)到適保存效果。1.0~1.4mL的樣品體積適合櫛江珧和近江牡蠣的研究結(jié)果，雙殼類精的超低溫冷凍保存起始于20世紀(jì)70年代。液氮罐